① 采集器孢子弹射法
采集孢子的装置可用玻璃钟罩或玻璃漏斗做成。蘑菇和香菇常用这种方法采集孢子。具体做法是：把玻璃钟罩或玻璃漏斗，放在一个垫有几层纱布的瓷 盘上，内放培养皿和不锈钢支架（漏斗内也可倒挂铁丝代支 架），上端通气孔用棉花塞住，然后用二层大纱布将整个装置包起来，高压灭菌后；移入无菌室备用。分离时把选好的种菇（八、九分成熟），切去菌柄基部送入无菌室，用0.1％～0.2％的升汞溶液或75％的酒精表面消毒1～2分钟后，放在无菌水中漂洗，除去表面药液，再用灭菌纱布揩手，插到不锈钢支架上或铁丝构上，静置1～2天，菌褶上的孢子大量散落到培养皿内，形成一层粉末状孢子印时，取下种菇，用灭菌的注射器，吸取3～5毫升无菌水，注入盛有孢子的培养皿中，轻轻搅动，便孢子均匀地悬浮于水上，再将注射器插上针头，吸取沉于底部的饱满孢子，注l～2滴悬液于试管斜面培养基，并使其均匀分布于培养基表面。或用接种针挑取少量的孢子直接在斜面培养基上划线。待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发快，生长良好的菌落，移接到新的斜面培养基上培养。
② 三角瓶约悬法
银耳、黑木耳常用此法采集孢子。兹以银耳为例，介绍其具体做法如下：选朵大、雪白、无病虫害的新鲜银耳，作为种耳，经无菌水漂洗种耳数次后，用无菌吸水纸把种耳表面的水分吸干。再把种耳切成一小块，以入瓶后不会碰到瓶壁为度，挂在用火焰灭菌过的小金属丝钩（或不锈钢钩）上，迅速悬挂在三角瓶内，注意勿使种耳磁到培养基，以防杂菌污染。塞上棉塞，放在20～25℃条件下，经l～2天，就可看到培 养基上形成一个雾状孢子印。此时，以无菌操作把悬挂瓶内的耳片取出，再塞上棉塞，移到20～25℃的室中培养，经2～3天，培养基表面就会出现许多乳白色糊状的白落，就是银耳的分生孢子。
采用孢子分离，要注意控制培养的温度。因为食用菌孢子的弹射与培养的温度有密切关系，如双孢蘑菇孢子弹射最适温度是14～18℃，如培养在25℃条件下，孢子就很难弹出。一般食用菌孢子弹射的最适温度比菌丝体生长的最适温度为低，而与子实体发育的最适温度大致相同。如香菇孢子弹射的最适温度为12～18℃，银耳为20～24℃，黑木耳为20～26℃，平菇为13～20℃。
此外，孢子采集还可采用菌褶涂抹法，适用于野外采种，方法简便，效果也好，即选成熟的种菇，用接种针直接插入褶片间，轻轻涂抹褶片表面尚未弹射的孢子，然后在试管培养基上接种。
2. 组织分离法
是用食用菌幼嫩的组织块直接分离培养成纯菌种的方法。选用的子实体先经0.1％开汞水或70％酒精表面消毒后。用无菌水冲洗并用无菌纱布擦去表面水分。分离香菇时用无菌解剖刀自菌柄处切开少许，再用手将子实体掰开为二，在菌盖与菌褶交界处，切取0.3～0.4立方厘米的一小块菌肉，移放在斜面培养基中央。如已开伞的种菇、则选菌盖与菌柄交界处的菌肉。分离草菇时，用无菌解剖刀把菌蕾纵切少许；再用手把菌盖轻轻剥开，在菌柄上方和菌盖交界处，切取1～5毫米的细块，接在斜面培养基中。如种菇已受雨淋，吸水较多，应取菌褶作为接种材料。组织分离后将试管外面放在恒温箱中培养。待组织块周围萌发出菌丝，并向 培养基蔓延生长后，再挑取生长健壮的菌丝进行转管培养。组织分离法操作简便，又不易带入杂菌，容易获得纯菌种。但对银耳、黑木耳等胶质菌；因其子实体中菌丝的含量极少，如用组织分离培养，则往往不易成功。
3. 基内菌丝分离法
是利用食用菌生长的基质一菇木和耳木作为分离材料，而培养成纯菌种的方法。特别是银耳、黑木耳采用这种方法，成功率高，性状也较稳定，为生产上经常采用的方法。具体做法是从野生或人工栽培的场所，选择子实体发生早，生长旺盛，朵大，无病虫害的菇木或耳木，锯取一小段，让其充分风干后备用。分离时如为香菇的菇木，先锯取1厘米的薄片，切去四周用0.1％升汞水表面消毒1～2分 钟，用无菌刀将其劈成小木片，再切成0.5平方厘米的小木条，移入试管斜面培养基上，经25～27℃培养，菌丝生长后，再行转管培养。
分离时如为银耳的耳木，先从长有子实体部位，锯取1～2厘米厚的木片，剔除树皮及耳基，再用0.1％升汞水或70％酒精涂擦表面消毒，通过耳基着生处，把耳木纵切为二，用无菌刀在耳基着生处，削取极小的木屑，移入试管斜面培养基上。接种后放在20～28℃的温度下培养，数天后接种块的周 围开始长出纤细的白色菌丝，延伸到培养基后，培养基的颜色逐渐变黄转黑，表面出现浅灰色斑纹，这就是羽毛状菌丝。一星期后，小木屑上出现白色短绒毛状菌丝，同时分泌白色或淡黄色水珠，这就是银耳的发育菌丝。挑取银耳发育菌丝和少 许羽毛状菌丝转接于新的斜面培养基上进行扩接，一星期后，菌丝长满试管，即成为母种。在实际分离中往往不可能得到银耳菌丝与羽毛状菌丝两者兼有的母种。或纯为银耳菌丝； 或纯为羽毛状菌丝；或酵母状分生孢子，还有相当数量是感染杂菌或不长任何菌丝的。纯银耳菌丝和纯羽毛状菌丝，经适当配合后，就可应用于生产。
黑木耳的耳木分离，其操作方法与银耳大致相同，但不象银耳有多种类型的菌丝。耳木接入试管后，一般放在22～28℃培养2～3天，可见菌丝长出。选生长健壮、清楚、两端展整齐的，进行转管纯化2～3次培育成母种。在培养过程中，有时培养基背面会出现乳白色或淡褐色，这是正常现象。
母种的扩大培养
从分离获得或外地引入的优良母种，由于数量有限不能满足生产上的需要，应进行扩大繁殖培养。其方法是以无菌操作把斜面培养基连同菌丝体切成短米粒大的小块，移接到新的斜面培养基上，在适温条件下培养，待菌丝长满斜面时即成。一般每支母种试管可扩大繁殖60～80支新管。扩大母种第一次应多些，以避免多次转管，造成菌丝生活力降低，结菇（耳）少，影响产量和质量。一般要求转管不要超过五次。
