《现代农业科技》 2008年第08期 作者：武模戈
摘要 利用拮抗试验、同工酶技术以及菌丝平板培养研究了14个平菇菌株的亲缘关系和培养特性。对亲缘关系研究的结果表明：14个栽培菌株分别属于4个品种，其中P1、P2、P5 亲缘关系较近，无拮抗反应，属同种异名；P3、P6、P11亲缘关系较近，无拮抗反应，属同种异名；P7、P8、P9、P10、P12、P13、P14亲缘关系较近，无拮抗反应，属同种异名；P4与所有供试菌株都发生拮抗反应，为独立品种。菌丝培养结果表明：P11生长速度最快，平均生长速度达到5.19mm/d，其次是P7、P6，分别为5.04mm/d和4.96mm/d，与其他菌株的差异达到极显著水平；P9最慢，平均生长速度达到2.23mm/d；P13、P8的生长速度分别为2.30mm/d和2.53mm/d，与其他菌株的差异也达到显著水平。综合不同菌株菌丝的生长速度和生长势，潜在的优良品种初步确定为P11、P7、P6、P14、P1和P10。
关键词 平菇；拮抗反应；酯酶同工酶；电泳；生长速度；生长势
中图分类号 S646.1+4文献标识码A文章编号1007-5739（2008）08-0005-03
平菇（Pleurotus ostreatus）在分类学上属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属[1]。全世界约有50种，我国是侧耳属真菌种类资源较为丰富的国家之一[2]。由于我国菌种管理制度不完善，加之管理力度不够，目前菌种生产、销售比较混乱。在大量的推广菌株中，存在着严重的同种异名现象，品种质量参差不齐[3]。菌种管理混乱给菇农引种和研究单位进行育种研究带来诸多不便，制约了平菇生产的健康发展。对在我省大面积推广的14个平菇菌株进行了拮抗试验、菌丝培养特性试验和出菇试验，以明确各菌株间的亲缘关系，选出适宜于本地区栽培平菇优良菌株，同时为今后进行杂交育种时亲本的选择奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株。供试菌株及其来源见表1。
1.1.2仪器与设备。BCM-1000生物洁净工作台（苏州净化设备有限公司制造）、101-1-BS恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂制造）、SPX-250型生化恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂制造）、电炉（上海中航五金机械厂制造）、培养皿（西安延河玻璃仪器厂制造）、试管、培养皿、接种钩、超净工作台、恒温培养箱、酒精灯、玻璃板、铁夹、注射器、电泳仪、电泳槽、有机玻璃条、容量瓶、试剂瓶、烧杯、移液管、吸耳球、滴管、玻璃圆盘、电冰箱、酸度计等。
1.1.3供试培养基。综合PDA培养基：配方为马铃薯（去皮）200g、葡萄糖20g、琼脂20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g、蒸馏水1 000mL，pH值自然。液体PD培养基：水1 000 mL、马铃薯（去皮）200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g。
1.2方法
1.2.1菌种活化与同步。将供试菌株在母种培养基上活化，再将活化后的菌种接种到综合PDA培养基上平板中央，在25℃恒温条件下培养7d，以保证后期试验中菌龄和接种量一致，减少试验误差。
1.2.2拮抗试验[4]。将14个供试菌株中的任意2个菌株配对组合，进行对峙培养，分别接种于综合PDA平板上，每皿接2个菌株，菌种块相距2.5cm，置25℃恒温箱中培养，观察有无拮抗反应。
1.2.3菌丝培养特性试验。将综合PDA培养基在微波炉中溶化，倒平板，在无菌条件下进行接种。接种时用直径6mm的打孔器沿活化后的菌种菌落边缘取相同菌龄的菌种块，分别接种在平板培养基中央，每皿接直径6mm的菌种1块，菌丝面朝上，轻压以防止滑动。每个品种设3个重复。接种后置于25℃的恒温箱中培养。观察菌丝生长情况，当生长速度最快的菌株即将长满平板时取出，观察比较菌丝生长势，测定菌落直径，计算菌丝生长速度[6]。
菌丝生长速度（mm/d）=（平均菌落直径-6）/（菌丝培养天数×2）
1.2.4同工酶电泳[5-6]。同工酶是指具有相同或相似的催化功能但酶分子的结构却不同的一组酶，一般认为同工酶是由染色体上不同的等位基因或不同基因座位编码的，它所表达的信息是分子水平上的信息。同工酶分析作为分子遗传标记技术之一，不仅被广泛用于动植物的遗传分析、生理生化研究，而且被作为化学分类的重要指标引进真菌的分类鉴定研究中，它弥补了菌落形态与颜色、孢子形态、子实体形态等特征传统真菌分类的不足，且简单易行，已逐渐成为该领域常用而重要的工具，特别是在属内种间以及品种之间的分类鉴定中是非常有效的。近年来，许多学者在利用同工酶技术进行食用菌育种和遗传分析上作了大量工作，本试验应用同工酶技术研究平菇14个菌株的酯酶酶谱相似性和差异性，并对14个菌株进行亲缘关系分析，为平菇分类、育种和平菇优劣的鉴定提供分子水平的依据。
1.2.4.1平菇菌丝液体培养。将活化后生长旺盛的菌丝分别接种于250mL装有80mL无菌PD液体培养基的三角瓶内，25℃恒温摇床培养7d，形成球状菌丝团。
1.2.4.2酶提取液的制备。从上述三角瓶中滤出菌丝，用蒸馏水冲洗2～3次，洗净其上培养基，离心，吸干水分，放入无菌的培养皿冰箱内冷冻24h后，加入与菌丝等重量的0.1 mol/L TBE缓冲液在冰浴上用研钵充分研磨菌丝成糊状，在10 000rpm条件下离心10min，取上清液，加入少量甘油置冰箱内4℃保存备用。
1.2.4.3电泳[7]。电泳最好在4℃左右进行，这样一方面可以防止电泳发热影响酶活力，另一方面可防止胶面断裂等问题发生。采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度7.5%，pH值8.9；浓缩胶浓度3%，pH值6.7；电极缓冲液为Tris-Gly系统，pH值8.3，点样量0.02mL，电泳指示剂为溴酚蓝，开始电泳采用100V的电压，待溴酚蓝进入分离胶后，加大电压至160V，当溴酚蓝距胶板底部1cm时，停止电泳。电泳结束后，取下胶板，放入酯酶染色液中，37℃下染色30min，待显出清晰酶带后取出，用蒸馏水漂洗数次，用7%醋酸固定脱色后，进行拍照并进行酶谱分析。
（1）制板。将玻璃板先用肥皂洗净，再用酒精擦1遍，晾干后待用。
（2）分离胶灌胶。将配制好的分离胶倒入固定好的玻璃板中，灌至距玻璃板凹槽3cm处，注入蒸馏水压平胶面。凝固大约30min。
（3）隔层胶灌胶。待分离胶凝固，与蒸馏水之间形成1条清楚的界面。将水倒出，用滤纸吸去多余的水，将配制好的隔层胶溶液倒入玻璃板，离凹槽3mm处，插入试样格，防止产生气泡。凝固大约40min。
（4）去试样格。两手拇指扣住试样格的柄，两手的食指和中指分别压住玻璃板的边缘，慢慢取出试样格。用滤纸吸去样品槽中多余的水分。去掉底部的有机玻璃条，吸去多余的水分。
（5）装板。用铁夹将玻璃板固定在电泳槽上，向电泳槽的下槽倒入电泳缓冲液，赶走气泡。用蓝色记号笔标记加样品的位置，记好顺序。
（6）加样。在相应的试样槽中，加入20μL样品、5mL 0.2％的溴酚蓝指示剂和5mL的电泳缓冲液。
（7）电泳。在4℃条件下，以160V的电压、15A的电流进行电泳，当溴酚蓝距胶板底部1cm时，停止电泳。
