简易深层发酵（吹氧）法或发酵罐法大量生产液体菌种，为了更好地控制培养条件，达到优质高产的目的，就需要对培养液中的污染情况、菌丝活力、菌丝体含量、菌丝球数量、PH值、总糖及还原糖、氨基酸、溶氧系数等的变化进行检测。现将有关的检测方法介绍如下。

　　（一） 感官检查。可采用“看、旋、嗅”的步骤进行检查。

　　看：将样品静置桌上观察。一看菌液颜色和透明度，正常发酵醪液（培养液）一般呈白色或黄褐色，清澈透明，菌丝颜色因菌种的不同或菌种见光程度而异，老化后颜色变深；染杂菌的醪液则混浊不透明。醪液变混，有两种可能性，一是细菌污染应予以淘汰；二是由于菌丝生长粘稠过大所致。若难以判断，可进行镜检。二看菌丝形态和大小，正常的菌丝大小一致，呈球状、片状、絮状，菌丝粗壮，线条分明；而染杂菌后，菌丝纤细，轮廓不清。三看上清液与沉淀的比例，菌丝体占比例越大越好，较好的液体菌种，在瓶中所占比例可达80%左右。四看pH值指标是否变色，在培养液中加入甲基红或复合指标剂，经3～5天颜色改变，说明培养液pH值到达5.0左右，为发酵点；如果在24小时内即变色，说明因杂菌快速生长而使培养液酸度剧变。五看有无酵母线，如果在培养液与空气交界处的瓶壁上有灰色条状附着物，说明为酵母菌污染所致，此称为酵母线。

　　旋：手提样品瓶轻轻旋转一下，观其菌丝体的特点。醪液的粘稠度高，说明菌种性能好；稀薄者表明菌球少，不宜使用。菌丝的悬浮力好，放置5分钟不沉淀，表明菌种生长力强；反之，如果菌丝极易沉淀，说明菌丝已老化或死亡。再次观其菌丝状态，大小不一，毛刺明显，表明是供氧不足；如果菌球缩小且光滑，或菌丝纤细并有自溶现象，说明污染了杂菌。

　　（二）显微镜杂菌查抄方法及步骤。

　　1、器材 显微镜，酒精灯/电火炉，载玻片，接种环，香柏油，二甲苯，擦镜纸，生理盐水；结晶紫染色液，碱性复红染色液。

　　2、操作步骤 涂片—干燥—固定—染色—水洗—镜检—观查结果

　　三、涂片。 取一块干净的载玻片，滴一小滴菌液于载玻片中央，用无菌操作，调匀并涂成薄膜。注意滴菌液时不宜过多，涂片必须均匀。

　　4、干燥。 于室温中自然干燥或用洒精灯/电火炉烘焙。

　　5、固定。 涂片面向上，于火焰上通过2-3次，使细胞质凝固，以固定细胞的形态，并使其不易脱落。但不克不及在火焰上烤，不然细胞形态将毁害。

　　6、染色。 放标本于水平位置，别离滴加染色液于涂片薄膜上，染色时间长短随不同染色液而定。结晶紫染色液染2-3分钟，石炭酸复红染色液约染1-2分钟。

　　7、水洗。 染色时间到后，用自来水冲刷，直至冲下之水无色时为止。注意郑州投资担保公司冲刷水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，制止直接冲在涂片处。冲刷后，将标本晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后才可置油镜下察看。

　　八、镜检

　　（1）低倍镜察看

　　（2）高倍镜察看

　　（3）油镜察看

　　①用粗调节器将镜筒提起约2厘米，将油镜转至正下方。

　　②在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。

　　③从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应加意不克不及压在标本上，更不可使劲过猛，不然不仅压碎玻片，也会损坏镜头。

　　④从接目镜内察看，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野呈现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面察看，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。

　　⑤察看完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许城市建设投资公司二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留油迹，最后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其它纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。

　　⑥将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成生辰八字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。

　　9、观查结果：

　　球菌在造就液中染色明显（较深）呈球状，杆状。

　　（三）斜面试管或空白造就基查抄法。在无菌条件下吸一滴或几滴菌液接入灭好菌后的斜面试管或空白培基上。将接过菌液的斜面试管或造就基置于24～32℃条件下造就，经24～48小时造就，察看杂菌。如菌丝生长旺盛、明净，接种面无红、黄、绿、黑色杂菌，证明液体菌种生长正常已经成熟，然后即可使用接种；不然，说明液体菌种已污染杂菌。

　　（四） 取样考试

　　1、菌丝活力检测 用显微镜察看虫草菌丝的边缘，以及菌丝粗细和我是90后作文分枝。造就液静置几分钟，无菌泥下沉，为活力强。

　　2、菌丝体含量测定 取不少于100毫升发酵液，水洗至水相澄清，在砂芯漏斗上以已知60℃烘焙重的滤纸真空抽滤，然后将菌丝体连同滤纸于60℃鼓风干燥2小时，快速称重，精确至0.01克。 菌丝体干重（克/100毫升）={菌丝体干重（克）×100}/发酵液取样体积（毫升）

　　三、菌丝球数量及大小测定

　　（1） 菌丝球数量测定 取不少于50毫升的发酵液，按一定比例在带塞量筒中加水稀释，摇匀后取一定量在直径150毫米的造就皿中摊匀，造就皿下垫方格纸，用方格法计数。 菌球数（个/100毫升）={菌球数（个）×100}/相当于发酵液体积（毫升）。发酵终点菌丝球浓度每毫升1000～1500个。

　　（2） 菌丝球大小测定。 在造就皿中取30个以上菌球排成一列，测量总长度，精确至1毫米。 菌球平均直径（毫米/个）=菌球总长度（毫米）/菌球数（个） 对于发酵液中菌球只占一定比例者，可先测得菌球占全般菌丝体的体积或小成本电影重量百分数，再测其大小和数量；菌球以球形或拟球形、直径大于1毫米、肉眼可辨者为准。

　　4、 PH值测定。 用PH检测仪或酸度计测定。发酵终点PH值下降至5。

　　5、总糖和还原糖测定。 接纳改良裴林法测定。

　　6、氨基酸态氮测定。 接纳甲醛法测定。

　　7、体积溶氧系数的测定。 接纳亚硫酸盐氧化法测定。

　　液体菌种制好后，应立纵然用，不克不及久放，若暂时不用，在常温下（15～30℃）一般可放置2～3天，最长不跨越7天。放置时间太长菌种容易老化或变质。如要生存菌种，可接纳冰箱低温生存，在4℃情况中存放3～6个月仍可繁殖。

　　通过液体菌种质量的检验，可以在早期实时精确地判断出液体菌种造就状况，制止认识不清多量量接种栽培，以免造成不必要的经济损失，对液体菌种的生产应用起到了保障效用。（完）

　　主要参考文献：

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