4.2.3 灭菌
常用的灭菌方式及适用对象见附录C。
4.2.3.1 高压蒸汽灭菌操作要求
a) 液体培养基、补料罐（包括消泡剂）、管道、发酵设备及空气过滤系统灭菌温度为121℃~125℃(压力0.103Mpa~ 0.168Mpa)，0.5h~1.0h。液体培养基装料量为50%~75%发酵罐容积。
b) 固体培养基物料灭菌温度为121℃~130℃，1.0h ~2.0h；或采用100℃灭菌2h~4h，24h后再灭菌一次。
c) 在高温灭菌会产生对菌体生长有害物质或对易受高温破坏物料灭菌时，应采用物料分别灭菌或降低灭菌温度延长时间。
培养基灭菌后按4.2.3.2进行检查。若灭菌不彻底，培养基不得使用。
4.2.3.2 灭菌效果检查
采用显微镜染色观察法和/或发酵管试验法检查培养基的灭菌效果。
4.2.3.2.1 染色观察法
a) 对待检测培养基无菌操作取样，在洁净载玻片上涂片、染色、镜检。
b) 若镜检发现有菌体，即可认为灭菌不彻底，需要进行4.2.3.2.2操作，无活菌体后培养基方可使用。
c) 若未发现菌体，初步认为灭菌彻底，培养基可以使用。在必要时,可进行4.2.3.2.2操作，以进一步确认培养基灭菌彻底。
4.2.3.2.2 发酵管试验法
用无菌操作技术将1mL供试培养基加至5mL已灭菌的营养肉汤中，重复三次。置于37℃培养，24h内无浑浊、镜检无菌体即可认为灭菌彻底。反之，即可判定培养基灭菌不彻底。
4.2.4 无菌空气
发酵生产中所通入的无菌空气采用过滤除菌设备制得，空气过滤系统应采用二级以上过滤。对制得的无菌空气按如下步骤检验合格后方可用于发酵生产。
用无菌操作技术，向装有100mL～200mL无菌肉汤培养基的三角瓶中通入待监测滤过空气10min～15min。三角瓶置于37℃培养，24h内无浑浊、镜检无菌体即判定合格。
4.3 发酵控制
4.3.1 接种量的要求
—— 摇瓶种子转向种子发酵罐培养的接种量为0.5%～5%；
—— 在多级发酵生产阶段，对生长繁殖快的菌种（代时<3h），从一级转向下一级发酵的接种量为5%~10%；对生长繁殖较慢的菌种（代时>6h），接种量不低于10%。
4.3.2 培养温度
发酵温度应控制在25℃~35℃，对特殊类型的菌种应根据其特性而定。在发酵过程中，可根据菌体的生长代谢特性在不同的发酵阶段采用不同的温度。
4.3.3 供氧
通常采用的供氧方式是向培养基中连续补充无菌空气，并与搅拌相配合，或者采用气升式搅拌供氧。
对于好氧代谢的菌株或兼性厌氧类型菌株，培养基中的溶解氧不得低于临界氧浓度；严格厌氧类型菌株培养基的氧化还原电位不得高于其临界氧化还原电位。
4.3.4 物料含水量
固体发酵初期适宜发酵的物料含水量为50%~60%。发酵结束时，应控制在20%~40%。
4.3.5 发酵终点判断
下列参数为发酵终点判定依据：
—— 镜检观察菌体的形态、密度,要求芽胞菌发酵结束时芽胞形成率≥80%；
—— 监测发酵液中还原糖、总糖、氨基氮、pH值、溶解氧浓度、光密度及粘度等理化参数；
—— 监测发酵过程中摄氧率、CO2产生率、呼吸熵、氧传递系数等发酵代谢特征参数；
—— 固体发酵中物料的颜色、形态、气味、含水量等变化。
4.4 后处理
后处理过程可分为发酵物同载体（或物料）混合吸附和发酵物直接分装两种类型。
4.4.1 发酵物同载体(或物料)混合吸附
对载体及物料的要求如下：
—— 载体的杂菌数≤1.0×104个/ g；
—— 细度、有毒有害元素（Hg、Pb、Cd、Cr、 As）含量、pH、粪大肠菌群数、蛔虫卵死亡率值达到产品质量标准要求；
—— 有利于菌体（或芽胞、孢子）的存活。
发酵培养物与吸附载体需混合均匀，可添加保护剂或采取适当措施，减少菌体的死亡率。吸附和混合环节应注意无菌控制,避免杂菌污染。
4.4.2 发酵物直接分装
对于发酵物直接分装的产品剂型，可根据产品要求进行包装。
4.5 建立生产档案
每批产品的生产、检验结果应存档记录，包括检验项目、检验结果、检验人、批准人、检验日期等信息。
4.6 产品质量跟踪
定期检查产品质量，并对产品建立应用档案，跟踪产品的应用情况。
附 录 A
（资料性附录）
农用微生物制剂生产工艺流程示意图（略）
附 录 B
（资料性附录）
农用微生物菌剂生产中菌种的常用保藏方式
保藏方式 一般存放条件 适合的微生物菌种类型 一般保存期限
冻干管保藏 冰箱或室温 各类菌种 5年以上
沙土管保藏 干燥条件 芽胞杆菌、真菌、放线菌 2年以上
石蜡油保藏 4℃冰箱 各类菌种 1年以上
甘油管保藏 -18℃冰箱或更低温度 主要是细菌 1年以上
固体曲保藏 干燥条件,4℃冰箱 产生各类孢子的真菌 1年以上
常规保藏 4℃左右冰箱 各类菌种 2个月~12个月
附 录 C
（资料性附录）
农用微生物制剂的生产中常用灭菌方法及适用对象
灭菌方式 操作要求 一般应用对象
高压蒸汽灭菌 115℃~130℃，20 min~60min 培养基，耐热器皿，废弃物
干热灭菌 160℃~170℃，1.5 h ~2h 耐热器皿，耐热物料
紫外线灭菌 距离紫外灯管（15W）≤1.2m，0.5h以上 洁净间，洁净台
化学药剂灭菌 浓度和用量根据具体情况而定 洁净间，设备及器材
辐射灭菌 辐射强度和时间根据具体情况而定 不适宜于热灭菌的物料
膜过滤除菌 过滤器的膜孔径≤0.2μm 空气，不宜于热灭菌的试剂
本网正在举办食用菌液体菌种设备的制作及其培养与应用技术培训， 纯长秸秆立体免架栽培食用菌新技术项目培训 欢迎参加。
