固态菌种生产技术操作规程

　　菌种是食用菌生产的基础，只有优良的菌种才可能有好的收成。菌种一般分为母种、原种或栽培种3级。无论制作哪一级菌种，关键应强调无菌观念，严格按照无菌技术要求进行操作。固态菌种生产技术操作规程如下：

　　1、范围

　　本标准规定了食用菌菌种的定义、操作规程、菌种质量标准以及标志、贮存、运输。本标准适用于各种食用菌母种、原种、栽培种。

　　2、引用标准

　　下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效，所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。

　　GB/T 12728-91　食用菌术语

　　DB33.B39.063-90　食、药用菌菌种质量标准

　　
　　3、定义

　　3.1　母种（一级菌种，俗称试管菌种）　由孢子、子实体组织、耳木或基质菌丝分离纯化，并在琼脂培养基上繁殖的菌种。

　　3.2　原种（二级菌种）　由母种移植到固体培养基繁殖的菌种。

　　3.3　栽培种（三级菌种，俗称生产种）　由原种移植扩大的菌种。

　　3.4　培养基　培养物生长所需营养物质的液体或固体混合物。

　　3.5　移植　将菌种从一种基物移接到另外的培养物中扩大培养的过程。

　　3.6　接种　将菌种移植在培养基物中的方法。

　　3.7　无菌　不含活杂菌体的状态。

　　4、菌种操作规程

　　4.1　母种操作规程

　　母种的制作大致经过以下几个过程：培养基配制→培养基灭菌→子实体分离或耳木分离或孢子分离→培养→转管纯化培养→母种。

　　4.1.1　培养基制作　

　　根据不同食用菌的不同营养需要配制不同的培养基。常用的配方有：

　　①、土豆葡萄糖琼脂培养基(简称PDA培养基)　土豆(即马铃薯)200克、葡萄糖20克、琼脂(凝固剂)20克。

　　②、土豆蔗糖琼脂培养基(PSA培养基)　土豆200克、琼脂20克、蔗糖20克、水1000毫升。

　　③、土豆胡萝卜琼脂培养基(PCA培养基)　土豆20克、胡萝卜25克、琼脂20克、水1000毫升。

　　④、土豆琼脂培养基(PA培养基)　土豆250—300克、琼脂20克、水1000毫升。　

　　4.1.2　容器　试管，试管应保持清洁、干燥、无菌。

　　4.1.3　灭菌

　　因为自然界里到处有微生物的存在，如空气、所有原料、水以及一切用具和器具的表面，这些微生物对食用菌菌种而言，都属于有害菌，即通常所说的杂菌。我们制作的菌种，要求绝对不能染上杂菌，所以必须进行严格灭菌。常用灭菌方法有：

　　①、高压蒸气灭菌　即用高压灭菌锅，通过加热增加锅内压力，使蒸气温度升高到120℃以上，在短时间内杀死一切微生物和它们的芽抱及抱子。原种用量较栽培种少，一般小批量生产使用这种灭菌方法，灭菌时间在1.5公斤/平方厘米的压力下，维持在0.5～1小时。

　　②、加热灭菌法　近年来普遍使用的一种方法是常压一次灭菌法，所需设备简单、投资少、成本低，适合我国农村使用。此法只要砌一个锅灶，买一口大锅，做几个蒸笼就可以了。把待杀菌的物品放入蒸笼里，从上气开始，保持蒸煮6～8小时，即可达到灭菌的目的。

　　③、紫外线灭菌法　开紫外灯30～40分钟，基本上可达杀菌目的，距照射物的距离以不超过1.2米为宜。注意紫外线对人体有伤害作用，所以不能用眼睛直视开着的紫外线灯，也不能开着灯工作。

　　4.1.4　母种分离

　　即通常将食用菌的子实体、土壤中的菌根、菌素分离或进行耳木分离或孢子分离，然后在培养基上培养，得到母种。作为分离母种的种菇、种耳，必须从高产、稳产、适应性强的优良品系群体中，通过挑选、对照、评审，然后择优选取个体健壮，朵形圆正，外表清洁，无病虫害的种菇或种耳，作为分离的母体。具休分离方法有以下几种：

　　①、孢子弹射法　分离前把子实体用无菌水冲数遍后，用滤纸吸干表面水分。然后在接种箱或无菌室内。把种菇的菌褶朝下，用不锈钢丝勾住，悬挂在二角瓶内培养基的上方。勿使接触到培养基或四周瓶壁。瓶口用棉花塞紧。置于该菌适宜的温度下培养。一般12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养基上，形成一层白色或其他颜色的粉未状孢子印。香菇、金针菇、银耳的孢子为白色，平菇极淡紫色，蘑菇、草菇为褐色。然后用无菌接种针沾取少量的孢子，在试管中的琼脂斜面培养基上接种待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早，长势好的菌落进行转管培养即得母种。

　　②、组织分离法　食用菌子实体，实质就是一团分化了的菌丝体，所以可从子实体中切取一小块放在培养基上培育，就可获得母种。这种分离法属于无性繁殖。具体操作：把经过筛选的优良品系的菇、耳子实体的组织块，作为分离材料。淋雨或吸水的种菇、种耳容易污染菌，一般不能作为分离材料。分离时，把种耳撕开，在菌盖和菌柄交界处或菌褶处，切取一小块组织作为接种物。银耳可以取耳片一点即可。为了减少带杂菌的机会，切取组织块时，应尽量小些，可得到的纯度高的菌种。然后接到斜面试管培养基的中央，在适宜的温度下培养，当组织块上长出菌丝，并向培养基上蔓延生长时，选择健壮、优良的菌丝体，移植到新的培养基上，进行扩大培养，即成为母种。

　　③、基内分离法　就是利用食用菌生育的基质作为分离材料，来得到菌丝体的一种方法。过去多用菇木或耳木的表面经过无菌处理，在该菌菌丝分布处切取接种块进行培养。近年来，银耳等均采用室内袋栽法。基内分离也就可以从栽培袋中挑选优良品系，割去子实体。取耳基作为分离材料。为了获得纯菌丝，先在袋内培养基的前端，挑取香灰菌丝少许，接入试管内培养。然后利用银耳菌丝和香灰菌丝的抗旱能力不同的特征，把分离材料进行风干或“迫干”脱水，然后剥取耳座内菌丝团，从中挑取灰白色粉状的菌丝体培养，得到纯白菌丝，再与香灰菌丝交合培养，即得母种。

　　无论采用那一种分离法，接种后都应当把试管放在抱子萌发或菌丝生育的最适温度下培养。一般培养7～10天就可以看到芒状的菌丝，经过鉴别，如无杂菌，所得的菌丝即为纯菌种。

　　4.1.5　母种转管扩大培养

　　用上述方法得到的母种数量有限，往往不能满足生产上的需要，因而需要通过接种来扩繁一批母种供生产用。当分离的纯菌种转管接种后菌丝已基本布满斜面时，即可进行母种的转管扩大培养。选择菌丝健壮、生长旺盛无老化、无感染杂菌的母种试管，在接种箱内，用接种刀把试管内的菌丝体连同培养基切成2×3毫米的小块，随即接入若干支的试管培养基中央，塞紧棉塞。接种完毕后，将试管放于恒温箱内培养。一般每支母种试管可扩大繁殖30～40新管。

　　转管接种操作要在严格的无菌条件下进行。其无菌操作要点如下：

　　①、将接种用母种试管和接种用试管夹在左手的母指和其他四指间。

　　②、右手拿接种刀，将接种刀置于酒精灯火焰内灼烧后，冷却1～2分钟。

　　③、将两支试管的棉塞用右手小指、无名指、中指夹住，慢慢拔下。然后将试管管口进行火焰灭菌并放在火焰无菌区内(一般在火焰上方3厘米和火焰周围1厘米范围内)。试管要与操作台面平行并稍向下倾斜。

　　④、将接种刀放入菌种试管内，把培养基分割成2毫米×3毫米小块，然后换用接种铲(灼烧，冷却)，轻轻挑敢一小块菌种，马上抽出移入另一待接种的试管斜面培养基中央贴放好。

　　⑤、将试管口与棉塞轻轻进行火焰灭菌后，迅速把棉塞塞进试管。
保藏的菌种在使用前，需先将菌种置于适温下，让其活化，然后及时使用转管，否则不易成活。转管应采用同一配方的培养基，可以收到较好的效果。

　　4.2　原种操作规程

　　原种也叫二级菌种，是由母种接种到瓶子或塑料袋里，经培养后得到的菌种。制作原种的目的，一是为了扩大种量，满足生产上的需要；二是让菌丝对各种秸秆类物质具有适应能力，并在适应的同时产生各种酶类；三是在培养过程中还可以对菌种的生命力、纯度等进行检验，存优弃劣。通过接种，一支母种可扩接3～5瓶原种。常见原种培养基配方：

　　4.2.1　培养基制作

　　①、锯末培养基：锯末(阔叶树)78％、米糖(或麦麸)20％、糖(红糖或白糖，下同)1％、石膏粉1％，水适量。

　　②、棉子壳培养基：棉子壳78％、麦麸或米糠20％、石膏粉1％、糖1％，水适量。

　　③、锯末玉米粉培养基；锯末(阔叶树)90％、玉米粉8％、糖1％、石膏粉1％，水适量。

　　④、稻草段培养基：稻草段78％、米糠或麸皮20％、石膏粉1％、糖1％。

　　⑤、锯末、棉子壳混合培养基：锯末40％、棉子壳40％、麦麸18％、石膏粉1％、糖1％，水适量。

　　⑥、酒糟培养基：干酒糟40％、棉子壳(或锯末)40％、麦麸18％、石灰1％、糖1％，水适量。
　　4.2.2　容器

　　采用750ml的常规玻璃菌种瓶，玻璃瓶应保持清洁、干燥、无菌。

　　4.2.3　装料

　　装料时要随加随压实，松紧适度，上下均匀一致，四周无空隙，瓶肩装结实，一般装到瓶肩为宜（约350g），料装好后，用锥形木棒在瓶中央打一洞或用手指在中央摁一小洞穴，然后塞上棉塞，瓶口无空隙，松紧、高度适当，以单独提瓶瓶不掉下，棉塞碰不到料面为准。

　　4.2.4　灭菌

　　同4.1.3。

　　4.2.5　接种

　　灭菌后的料瓶放在干燥清洁，且通风条件好的室内冷却至10℃以下，放入接种箱内，用甲醛、高锰酸钾将料瓶外壁作杀菌处理。接种时，用接种铲将母种菌丝连同培养基切成25×200mm小段，每一小段接3～4瓶，接植于料瓶洞口，塞上棉塞。

　　4.2.6　培养

　　将接种后的菌种瓶立即放入温度控制在20～25℃、相对湿度70%左右的培养室内培养。在发菌培养阶段，菌种瓶必须竖放，待菌种萌发吃料后，可卧倒叠放，培养7～10天后检查有无杂菌；及时剔除，在整个培养过程中检查2～3次，直到菌丝长到瓶底，备用。

　　4.3　栽培种操作规程

　　4.3.1　培养基制作　同4.1.1。

　　4.3.2　容器

　　采用750ml的常规玻璃菌种瓶，水果罐头瓶，低压聚乙烯或聚丙烯塑料袋等。

　　4.3.3　装料

　　同4.2.3。

　　4.3.4　灭菌

　　同4.1.3。

　　4.3.5　接种

　　选择菌丝色白、生长有力、清晰、无杂菌的原种作为接种材料。接种时敲掉原种瓶底，用镊子夹取少量菌丝块，接在培养基洞口，每瓶原种接50～60瓶栽培种，离瓶口3～4cm处的砂厚种弃之不用。

　　4.2.6　培养

　　接种后菌种瓶整齐排放在干燥清洁的培养室内，温度一般控制在20～25℃，相对湿度为70%左右。5～7天后检查有无杂菌，之后每隔15天左右检查一次，直至菌丝长到瓶底，备用。

　　5、菌种质量标准

　　5.1　外观

　　菌丝呈白色或灰白色，有线条状菌束，伸展整齐、健壮，不徒长，不结块，瓶肩处不退菌，瓶底不吐黄水，瓶口棉塞完整，不松动、不脱落。

　　5.2　气味

　　有鲜菇味，无其他异味。

　　5.3　菌丝状态

　　菌丝生长应均匀一致，无断裂、无萎缩及明显的菌丝退化现象，不应有黄斑状的菌丝或吐黄水现象或锈色水滴，摇动时无松动状，手感潮湿。

　　5.4　杂菌、害虫

　　菌种应无杂菌污染、无害虫滋生。

　　5.5　适宜的菌龄

　　栽培种菌龄一般75～100天（自接种到下种），时间过长会出现菌丝退化、吐黄水等现象。

　　5.6　重量适当

　　750ml的玻璃菌种瓶一般800～850克，过重则表明料太湿或装料偏紧，过轻则表明料偏干或装料过松，均不利菌丝生长。

　　6、标志、贮存、运输

　　6.1　标志

　　出售的菌种必须贴有菌种质量合格标签，注明菌种种类、级别、品种、生产单位、接种日期。

　　6.2　贮存

　　6.2.1　母种保存方法

　　可把试管放在室温15℃的室内保存，冬季应移入恒温箱内，防止受冻。此法适于草菇、银耳等在夏、秋季节生产的高温菌类。而香菇、平菇、蘑菇、朴菇、黑木耳等秋冬季节生产的菌种，可置于0～7℃的冰箱中保存。也可把试管口用腊封好后，再包上塑料薄膜，沉在清凉的井底保存。低温保存、每隔3～5个月就应转管移接一次，在适宜的温度下培养一星期，待菌丝基本布满斜面后，再放在低温中保存。

　　6.2.2　原种保存方法

　　原种连同菌种瓶用牛皮纸包好，放在4～14℃的温度下可保存工年左右。

　　6.2.3　栽培种保存方法

　　栽培种因运输、气候等原因，一时用不定，可暂时放在阴凉、干燥、通风、阴暗的室内保存。

　　6.3　运输

　　各级菌种不得在气温30℃运输，在运输中需要防震、防潮、防晒、防污染措施。

　　附：

　食用菌卫生管理办法(卫生部)

　　第一条　为贯彻预防为主的方针和执行《中华人民共和国食品卫生法(试行)》，加强食品卫生管理，提高食用菌的卫生质量，保障人民身体健康，特制订本办法。

　　第二条　本办法管理范围系指蘑菇、香菇、草菇、木耳、银耳、鸡(土从)、猴头等鲜、干食用菌及其制品。

　　第三条　为防治病虫害，使用药物消毒杀虫时，仅能用于菇房,并应严格掌握用量，　严禁使用1605、1059、666、DDT、汞制剂、砷制剂等高残毒或剧毒农药。

　　第四条　栽培食用菌使用的材料，应报请当地食品卫生监督部门审查，符合卫生要求，方能生产、销售。

　　第五条　食用菌制品，使用添加剂应符合现行的《食品添加剂使用卫生标准》。原料用水应符合现行的《生活饮用水卫生标准》。

　　第六条　食用菌生产购销部门，必须加强毒菌、食菌鉴别知识的宣传，建立质量检验制度，对食用菌要做到专人负责，分类收购，严格检查，防止毒菌混入，严禁掺假、掺杂。

　　第七条　食用菌的包装、贮存、运输必须符合卫生要求，严禁使用装过农药、化肥及具他有毒物质的容器包装，严禁与农药、化肥、中草药材和其他杂物混堆、混运。

　　第八条　为了加强食品卫生管理，食品卫生监督机构可以向生产、销售等单位，根据需要按手续无偿采取样品检验，并给予正式收据。