章逸 边银丙 《食用菌学报》 2008年第03期
摘要:概述了食用菌病毒病的种类、危害特征、检测技术及防治措施等方面的研究现状,提出了食用菌病毒病研究中存在的问题,并展望了食用菌病毒病研究的发展趋势。
关键词:食用菌;病毒病;检测;防治
S646A
病毒病是食用菌生产中较重要的一类病害。病毒病害与细菌、真菌、线虫病害危害不同,其发病症状具有潜隐特性,直到生产中的某个时期才开始显症,因此是危害食用菌生产较为严重的一类病害。随着研究技术的不断进步,研究水平的不断提高,已在双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、香菇(Lentinula edodes)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、草菇(Volvariella volvacea)、茯苓(Wolfiporia cocos)、银耳(Tremella fuciformis)和金针菇(Flammulina velutipes)等食用菌中检测到病毒或类似病毒颗粒(Virus Like Particles,VLPs),并获得了部分食用菌病毒或VLPs的基因组序列[1~36] 。
1 食用菌病毒病及其危害
1.1双孢蘑菇病毒病
1950年,美国宾夕法尼亚州La France兄弟在双孢蘑菇菇房中发现了“La France disease”,后称为“Die-back disease”,这是最早报道的食用菌病毒病害,发病双孢蘑菇菌柄细长、菌盖薄、生长停滞、产量显著下降[1, 37]。随后,英国、荷兰等国家相继发现了该病害,发病症状虽因栽培地区、栽培条件、病毒侵染时期不同而有所不同,但总体表现为子实体畸形、变色和产量显著下降[2, 3]。目前,“La France disease”在全世界范围内均有发生,给双孢蘑菇生产造成了严重的影响[4]。“La France disease”的病原很复杂,在不同感病双孢蘑菇中曾检测到至少6种病毒或VLPs,而其作用机制目前仍不是很清楚,但可以肯定,其中至少有一种病毒及其dsRNA(Double-stranded RNAs)与症状有明显的相关性[5~7]。通常认为,与典型的“La France Disease”相关的病毒是34~36 nm的等轴状病毒颗粒(La France Isometric Virus, LIV)。LIV的 dsRNA至少有6条,最多时可以检测到9条,按片段长度大小可分为大(L1: 3.6 kbp; L2: 3.0 kbp; L3: 2.8 kbp; L4: 2.7 kbp; L5: 2.5 kbp)、中(M1: 1.6 kbp; M2: 1.4 kbp)和小(S1: 0.9 kbp; S2: 0.8 kbp)三类,其中M1、S1和S2在感病双孢蘑菇中很少检测到。目前,已测定了L1、L3、M1、M2的全长基因组序列和L5的大部分基因组序列,5个序列中只有L1由核苷酸推测的氨基酸序列与数据库中依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)序列相似[7~11]。该等轴状病毒颗粒(至少6条dsRNA)可以通过菌丝接合或感病孢子传播传染[2, 3, 5, 6]。在感病双孢蘑菇中发现的另一种与“La France Disease”相关的病毒是19×50 nm的细菌状病毒颗粒(Mushroom Bacilliform Virus, MBV)。MBV是+ssRNA(single stranded RNA)单分体基因组病毒,是Barnaviridae科中Barnavirus属的唯一成员。目前已获得其全长基因组序列,长度为4 kbp,包括4个开放阅读框架(open reading frames, ORFs),分别编码20 KDa、73 KDa、47 KDa和22 KDa的多肽。序列分析表明,其ORFs组成和由核苷酸序列推测的氨基酸序列与黄症病毒组( Luteoviruses)的亚组Ⅱ和南方菜豆花病毒组(Sobemoviruses)相似[12]。Revill等也分析了MBV基因组结构特征及其表达机制[13, 14]。
1996年,在英国发现了双孢蘑菇的另一种病害“patch disease”,其发病症状表现为产生无菇区、出菇期推迟、白色品种子实体褐变、提前开伞、子实体畸形等中的一种或几种,导致双孢蘑菇质量和产量下降。Gaze等发现了与“patch disease”相关的一些新的dsRNA,推测其可能是一种新的病毒,并将此病毒命名为Mushroom virus X(MVX)[15, 16]。现在,“patch disease”在欧洲一些国家均有发生[18]。MVX dsRNAs多达26条(0.64 kbp ~ 20.2 kbp),有23条dsRNAs与症状相关,其中4条小的dsRNAs(2.0 kbp,1.48 kbp,0.8 kbp,0.6 kbp)与菌盖褐变有关,另有3条dsRNAs(16.2kbp,9.4 kbp,2.4 kbp)在健康的样品中也能检测到。目前,已测定了部分dsRNAs的基因组序列。dsRNAs的种类及浓度或丰度因样品不同变化很大。根据MVX dsRNA的数量、大小和图谱分析,认为MVX可能是多种病毒的复合体。此外,在投射电镜下没有发现这些dsRNAs有外壳蛋白包被[17, 18]。
1.2香菇病毒病
香菇带毒是香菇栽培中的常见问题,香菇感染病毒后的症状主要表现为菌丝生长缓慢、长势减弱、子实体畸形、质量和产量降低等[19~23]。国内外的研究人员先后从生长不正常的香菇子实体和菌丝体中分离到了包括球状、杆状和蝌蚪状(噬菌体)的病毒颗粒或VLPs[19, 22, 23]。日本的Ushiyama(1977)在生长不正常的香菇子实体中检测到直径分别为25 nm、30 nm和39 nm(主要类型)的球状病毒颗粒,以及长度可达1500 nm易弯曲的长线状和大小为280~300 nm×25~28 nm 的杆状VLPs[19]。我国的沈学仁等(1992)从生长不正常的香菇菌丝体中也分离到一种直径为34 nm、CP分子量为22 kDa、基因组为+ssRNA的球状病毒颗粒,电镜下观察发现,病毒颗粒表面光滑无外膜,常呈晶格排列[22]。梁振普等(2005)在香菇中发现了直径约为30 nm的球状病毒和头部直径约为40 nm的噬菌体两种病毒颗粒[23]。
1.3侧耳病毒病
我国的学者(1990)在美味侧耳(P. sapidus)、糙皮侧耳、漏斗状侧耳(P. sojor-caju)、佛罗里达侧耳(P.florida)等侧耳属食用菌中发现病毒病害[24, 25]。美味侧耳中的病毒颗粒可分为球状(φ19、φ25、φ32 nm)和杆状(40~600 nm× 12~14 nm)两种,基因组主要由4条dsRNA组成;糙皮侧耳、漏斗状侧耳和佛罗里达侧耳中的病毒粒子为等轴对称病毒,直径在23 nm左右[24]。通过对感染病毒的糙皮侧耳子实体进行超微结构分析发现,病毒主要分布于子实体层和柄细胞的细胞质或泡囊内,在细胞间的分布不均匀,且能通过隔膜孔器进行细胞间易位[25]。
韩国近几年也相继报道了糙皮侧耳[26~29]和刺芹侧耳病毒病害[30]。糙皮侧耳病毒病害症状因病原不同而表现为子实体畸形或不显症,但产量均显著下降。病毒主要有与 “La France disease” 相关的糙皮侧耳球形病毒(oyster mushroom spherical virus, OMSV) [26],感染后不产生明显症状的糙皮侧耳病毒Ⅰ(Pleurotus ostreatus virusⅠ, PoVⅠ)[27],感染后在菌丝体和子实体阶段均出现明显表型不正常症状的糙皮侧耳等轴状病毒(oyster mushroom isometric virus, OMIV)[28],以及最近在糙皮侧耳菌株(Shin-Nong )上发现的糙皮侧耳病毒SN(Pleurotus ostreatus virus SN, PoV-SN)病毒[29]。以上4种病毒颗粒形状均为等轴球状,除OMSV为+ssRNA病毒外,其它3种为dsRNA病毒,目前已测得了OMSV和PoVⅠ的全长基因组序列,以及PoV-SN的部分基因组序列。危害刺芹侧耳的病毒为刺芹侧耳球形病毒(Pleurotus eryngii Spherical Virus, PeSV),是+ssRNA病毒,基因组全长为7.8 kbp[30],病害症状表现为菌丝体退化、菌柄短而粗、菌盖平而具不规则形状,产量下降等。
1.4其它食用菌病毒病害
除了上述食用菌病毒病害外,在茯苓、银耳、草菇和金针菇中也发现了病毒病害[31,32]。草菇中的病毒主要是直径23 nm的等轴对称粒体,基因组为dsRNA [31]。金针菇中的病毒(Flammulina velutipes virus, FVV)为直径50 nm的等轴对称粒体,基因组为dsRNA,分成两个片段,大小分别为1.8 kbp和1.9 kbp。FVV与金针菇子实体褐变、质量和产量下降相关 [32]。
2 食用菌病毒病检测技术
食用菌病毒病害的研究起步较晚[2],传统的检测手段主要是电子显微镜观察和dsRNA技术。电子显微镜观察病毒粒子形态是最为可靠的一种方法,但受病毒粒子提纯困难的限制;dsRNA技术是用于检测食用菌病毒最为普遍的手段,已分离纯化的食用菌病毒中除MBV、OMSV和PeSV的基因组为+ssRNA外,其余的均为dsRNA病毒,且多分体现象比较普遍。
近年来,随着食用菌病毒的不断发现和研究的深入,血清学及分子生物学等快速检测技术也相继应用于食用菌病毒的检测上。目前,以提纯的病毒粒子为抗原, 制备出了OMIV、OMSV和PeSV的抗血清,并建立了这三种病毒的三抗体夹心酶联免疫吸附测定(triple-antibody sandwich-enzyme-linked immunosorbent assay, TAS-ELISA)快速检测方法[28, 30, 33]。基于已经获得的部分食用菌病毒基因组序列,反转录聚合酶链式反应(reverse trans criptase polymerase chain reaction, RT-PCR)已成功应用于食用菌菌种、栽培基质、覆土及子实体中LIV、MBV、MVX、OMSV、POVⅠ、PoV-SN等病毒的快速检测上[13, 18, 27, 29, 34, 35]。最近,Kim 等利用原核表达技术,以重组的OMSV RdRp为抗原制备了单克隆抗体,并建立了OMSV的蛋白质微列阵快速检测技术[33]; Kim 等还建立了OMSV的表面等离子激元共振(surface plasmon resonance, SPR)生物传感器快速检测技术,这两项检测技术无论是检测的灵敏度还是速度都比TAS-ELISA和RT-PCR方法更加先进[36]。另外,核酸分子杂交也已广泛应用于病毒的检测[11, 27, 29]。
3 食用菌病毒病害防治
目前,食用菌病毒侵入寄主后如何复制、调控以及对寄主的作用机制尚不清楚,因此,在短时期内选育出抗病毒菌株,或研制出高效的化学或生物农药来防治病毒病比较困难。食用菌病毒是真菌病毒的一部分,主要通过正常和患病菌丝之间的胞质融合传播(水平传播),以及患病菌丝或孢子传播(垂直传播)。建立快速灵敏的病毒检测技术,在感病菌株的潜隐阶段、或在感病孢子弹射之前及早发现病毒,及时清理,是控制食用菌病毒病危害的一种较为有效的方法。此外,食用菌栽培中采取严格的清洁措施,使用无病毒材料也是食用菌病毒病害有效的防治措施,可尝试通过菌丝尖端分离、原生质体再生等方式获得无病毒材料。
4 存在的问题及展望
与其它作物病毒病的研究相比较,食用菌病毒病害的研究范围较窄、研究起步较晚、研究基础较薄弱。目前仅研究了少数几种栽培食用菌的病毒病害,对极个别病害,如“La France disease”研究的较多、研究范围较广,而对其它病毒病的研究多停留在病毒的发现及检测上,且检测技术还有待进一步改进。在食用菌病毒病害的研究中,除通过柯赫氏法则全过程验证了双孢蘑菇部分病毒与寄主之间的侵染关系外[2],其它食用菌病毒或VLPs与寄主之间并没有结论性的侵染证据,这些病原或疑似病原的起源、如何侵入寄主、在寄主中如何复制、调控及其对寄主的作用机制可以说是知之甚少。
我国食用菌栽培过程中经常会出现菌种退化、质量和产量降低等问题,其原因之一可能是病毒病害引起的;国内一些栽培区也发现了食用菌病毒病害[20~23],但食用菌病毒病害的危害情况、病原种类等并不是很清楚。因此,建议今后加强对食用菌病毒病害的基础性调查工作,在调查鉴定病毒种类的基础上,研究病毒生物学及理化特性,并借助分子生物学技术及其它高新技术分析病毒或VLPs的基因组结构和功能,为揭示病毒与寄主之间的互作关系提供理论依据。同时在已知病毒基因组序列的基础上改进病毒检测方法,以降低由病毒危害造成的经济损失。此外,广泛应用生物学技术和生物物理等方法,开展食用菌脱毒方面的研究也是今后的研究方向。
参考文献：略
