金 丹 李宝聚 石延霞 谢学文 《食用菌学报》 2009年第01期
摘 要: 本文将从平菇(Pleurotus ostreatus)褐斑病中分离纯化的240多个菌株中,选出使平菇褐斑病发病快且病情严重的菌株PG1702,对其进行致病性试验,结果表明菌株PG1702为引起平菇细菌性褐斑病的病原菌;显微形态的观察和扩增出的16S rDNA序列与GenBank比对结果表明菌株PG1702为托拉斯假单胞杆菌(Pseudomonas tolaasii Paine)。
关键词: 平菇;褐斑病;托拉斯假单胞杆菌
我国作为食用菌生产大国,总产量约占全世界的70%以上,而平菇是我国北方的重要栽培种类。最近几年北方平菇种植地区平菇褐斑病大面积发生,此病一旦发生,传播迅速,很难防治,造成了严重的经济损失。褐斑病已经影响了菇农的经济效益,因此加快对褐斑病的研究、探索有效的预防控制手段迫在眉睫。本研究将形态鉴定方法与分子生物学技术相结合,对引起平菇褐斑病的病原菌进行鉴定,旨在为进一步研究该病害奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
平菇褐斑病菌株: 2007年8月~2008年10月,从辽宁、山东以及北京周边地区采集大量平菇褐斑病病样,共分离纯化了240多个菌株。
平菇:品种是397,由中国农科院农业资源与农业区划研究所张金霞老师提供菌种,本实验室栽培。
1.2 培养基
NA培养基:牛肉浸膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,琼脂18g,蒸馏水1000mL,pH7.0。
KB培养基:蛋白胨20g,甘油10g,MgSO41.5g,K2HPO41.5g,琼脂15g,蒸馏水1000mL,pH7.2。
LB培养基:蛋白胨10 g,酵母膏5 g,NaCl 10 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0。
平菇培养料:棉籽壳86.8%,麦麸13%,生石灰0.2%,含水量58%。
1.3 平菇栽培方法
采用23 cm×35 cm的聚乙烯塑料袋,每袋装料量1 kg。养菌期间,温度、相对湿度控制在25 ℃、65 %左右,发菌天数约为25 d。出菇期温度控制在12~17 ℃、空气相对湿度控制在70%左右,给予散射光照,适当通风,当子实体直径生长到1~2 cm左右时开始接种试验。
1.4 致病性测定
将根据参考文献[1]分离纯化的菌株在NA平板上25 ℃培养72~96 h,将细菌刷下配置成3×108个/mL的悬浮液20 mL,待平菇子实体直径为1~2 cm左右时,用毛笔将1 mL菌悬液均匀涂抹在子实体上,针刺法接种[2],设置清水对照,3次重复。接种后保湿24 h[2],之后进行常规管理,并开始观察发病情况,选出使平菇褐斑病发病快且病情严重的菌株。
1.5 病原菌微观形态观察[3]
将致病性测定选出的菌株在NA培养基上培养24~48 h后,用亚甲蓝染色,油镜下观察细菌的形态和大小。
1.6 培养性状及荧光性的观察
将致病性测定选出的菌株在KB培养基上培养48 h后观察菌落形态,在波长254 nm紫外灯下观察是否有荧光产生。
1.7 16S rDNA 分子鉴定[4,5]
1.7.1 CTAB法提取细菌DNA
将菌株PG1702接种于液体LB培养基中,27 ℃振荡培养过夜。取2.0 mL培养物15 000 g 离心10 min。沉淀物加入568 μL的TE缓冲液,反复吹打使之重新悬浮,加入30 μL 10%SDS和15 μL的蛋白酶K,混匀,37 ℃温育1 h。然后加入100 μL 5 mol/L NaCl, 充分混匀,再加入80 μL CTAB/NaCl溶液,混匀后65 ℃温育10 min,加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混匀,15 000 g离心10 min,将上清转入一只新管中,加入0.6~0.8倍体积的异丙醇,轻轻混合15 000 g离心10 min,使DNA沉淀下来,用1.0 mL的70%乙醇洗涤后,再离心弃上清液,在洁净工作台中稍加干燥,重溶于20 μL TE缓冲液(含RNaseA<25 ng/mL)中,准备电泳检测。
1.7.2 PCR扩增
利用16S rDNA的通用扩增引物[5]SF:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和SR:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增。
PCR反应体系(50 μL)为:5 μL 10×TB 缓冲液(含2.5 mmol/L Mg2+),dNTP(1.0 mmol/L)5 μL, 正向和反向引物(10 μmol/L)各2.5 μL, 5 mmol/L Taq DNA聚合酶2.0 μL,模板5 μL。
PCR反应条件为:94 ℃ 预变性5 min,94 ℃变性 30 s,52 ℃退火 30 s,72 ℃延伸1 min,30 个循环。
扩增后取3 μL PCR 反应产物在 2.0 %的琼脂糖凝胶电泳30 min 后,置紫外透射仪下观察 DNA特异性条带。
1.7.3 PCR产物测序
PCR产物测序由中国农业科学院作物所完成。
2 结果与分析
2.1 致病性测定结果
致病性测定结果表明:菌株PG1702使平菇397褐斑病发病快且最严重。将菌株PG1702接种5袋平菇397的子实体,接种后密切观察平菇397的生长以及发病情况,发现接种后24 h左右平菇397发病,病情严重(见封三图1),无论是病斑形状还是发病部位都与平菇褐斑病自然发病的症状相同(见封三图2),对照未发病(见封三图3)。
2.2 显微形态
菌株PG1702在蛋白胨琼脂培养基上培养41 h后,用亚甲蓝染色,油镜下可观察到细菌呈杆状,大小约为0.5~0.9 μm×1.4~3.4 μm(图4);革兰氏染色阴性;一极或两极具有一根或多根鞭毛。
2.3 培养性状
菌株PG1702在NA培养基上培养48 h后,菌落乳白色、粘稠、稍隆起、表面光滑、呈圆形、边缘整齐(图5),上述特征与张学敏等[6]描述的托拉斯假单胞杆菌(P. tolaasii)培养形态基本一致。菌株PG1702在KB培养基上培养48 h后,在波长254 nm紫外灯下有荧光产生。
2.4.1 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
使用2%的琼脂糖凝胶进行电泳,结果表明,基因组DNA中扩增出的16S rDNA 核苷酸片断与DL2 000 Marker 比较, 约在1 500 bp 处有一明亮的PCR 特征性条带,其分子量大小与菌株16S rDNA的理论值基本相符(图6),双蒸水为PCR反应模板进行的对照(CK)则无条带。
2.4.2 DNA测序结果比对
将供试菌株PG1702测得的16S rDNA序列与GenBank的核酸数据进行比对,与GenBank中的登录号为AF320990.1、AF094750.1、AF255336.1的相似性均达到99%。因此,判断菌株PG1702为托拉斯假单胞杆菌(P. tolaasii Paine)。
3 结论与讨论
通过致病性测定将从平菇褐斑病中分离纯化的240多个菌株中,筛选出使平菇褐斑病发病快且病情严重的菌株PG1702为引起平菇细菌性褐斑病的病原菌;显微观察结果菌株PG1702与托拉斯假单胞杆菌(P. tolaasii)形态基本相同,进一步对该菌株进行16S rDNA分子检测,扩增出的序列登录 GenBank比对后,与托拉斯假单胞杆菌(P. tolaasii)的相似性达到99%,因此确定该菌株为托拉斯假单胞杆菌。
1915年,TOLAAS[7]首次报道了蘑菇细菌性褐斑病,随后Paine将病原细菌鉴定为P. tolaasii;
1999年,MURATA[8]对平菇褐斑病的致病菌托拉斯假单胞杆菌进行了研究,描述了托拉斯假单胞杆菌不同环境条件下的微观形态。本研究在国外已有研究的基础上,借鉴其研究方法同时结合自身的试验条件对国内采集的平菇褐斑病进行了鉴定,明确其病原为托拉斯假单胞杆菌(P.tolaasii),这为筛选有效的防治药剂、采取防治措施和抗病品种选育的研究提供了依据。
参考文献:
[1]BESSETTE AE, KERRIGAN RW, JORDAN DC. Yellow blotch of Pleurotus ostreatus[J]. Appl Environ Microbiol, 1985, 50(6):1535-1537.
[2]GANDY DG. A technique for screening bacteria causing brown blotch of cultivated mushrooms[J]. Rep Glasshouse Crops Res Inst, 1968: 150-154.
[3]方中达.植病研究方法[M]. 北京:北京农业出版社,1998:181-182.
[4]刘雅琴, 任毓忠, 李国英, 等. 新疆棉花细菌性烂铃病病原菌鉴定[J]. 植物病理学报, 2008, 38(3):238-243.
[5]STACKEBRANDT E, GOODFELLOW M. Nucleic acid techniques in bacterial systematics[M]. New York: John Wiley and Sons. 1991:115-175.
[6]张学敏,杨集昆,谭 琦.食用菌病虫害防治[M].北京:金盾出版社, 1996:154,158-159,163-164.
[7]TOLAAS AG. A bacterial disease of cultivated mushroom[J]. Phytopathology, 1915, 5: 51-54.
[8]MURATA H. Characteristics of stress response in a mushroom-pathogenic bacterium, Pseudomonas tolaasii, during the interaction with Pleurotus ostreatus and carbon/nitrogen starvation in vitro[J].Mycoscience, 1999,40 (1):81-85.
Identification of a Bacterium Causing Brown
Blotch Disease of Pleurotus ostreatus
JIN Dan1,2,LI Baoju1*,SHI Yanxia1,XIE Xuewen1
1Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;
2Institute of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang, Liaoning 110161, China
Abstract:A bacterium, strain PG1702, identified from more than 240 strains isolated from Pleurotus ostreatus mushrooms collected at different locations in China, was shown to cause severe brown blotch disease of P. ostreatus. Morphological characterization and 16S rDNA sequence analysis confirmed that isolate PG1702 was Pseudomonas tolaasii.
Key words:Pleurotus ostreatus;brown blotch disease;Pseudomonas tolaasii
